一、SuperscriptII—RT合成第一鏈

 

　　1.在一RNase-free的0.2mlPCR管中加入xulmRNA(大約500ng)、1ulXhoIPrimer(1.4ug/ul)、

 

　　(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)、11-xulRNase-freewater）

 

　　說(shuō)明：大于500ngmRNA分n管(500ng/tube)合成第一鏈，第一鏈合成完畢后將n管合成一管進(jìn)行第二鏈合成。

 

　　2.混勻后，70℃反應(yīng)10分鐘。

 

　　3.反應(yīng)完成后，立刻將反應(yīng)體系置于冰上5min。

 

　　4.稍微離心一下，順序加入以下試劑：

 

　　（1）4ul5×firststrandbuffer

 

　　（2）2ul0.1MDTT

 

　　（3）1ul10mMdNTP(自己配制)

 

　　cDNA文庫(kù)顯然比基因組DNA文庫(kù)小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得到細(xì)胞特異表達(dá)的基因。但對(duì)真核細(xì)胞來(lái)說(shuō)，從基因組DNA文庫(kù)獲得的基因與從cDNA文庫(kù)獲得的不同，基因組DNA文庫(kù)所含的是帶有內(nèi)含子和外顯子的基因組基因，而從cDNA文庫(kù)中獲得的是已經(jīng)過(guò)剪接、去除了內(nèi)含子的cDNA。